关键词：免疫组化染色

（1）烘片：将石蜡切片放入在60 ℃烘箱中烘片至少60分钟（烘片能提高脱蜡效果，为了省时省力也可过夜烘片，但烘片时间不能过长，否则可能损坏组织）；

（2）脱蜡：将烘好片的石蜡切片完全浸入（至少超过组织，下面也一样）二甲苯中进行脱蜡处理：二甲苯Ⅰ 20 分钟，二甲苯Ⅱ 20 分钟（二甲苯脱蜡时间越长，脱蜡效果越好，二甲苯脱蜡次数越多，脱蜡效果越好；一般选择2次二甲苯，每次20分钟）；

（3）水化：将脱蜡好的石蜡切片依次、完全浸入不同浓度乙醇中进行水化处理：100% 乙醇 10 分钟，100% 乙醇 10 分钟，95% 乙醇 5 分钟，90% 乙醇 5 分钟，85%乙醇 5 分钟，70% 乙醇 5 分钟，自来水或PBS润洗石蜡切片几次（乙醇水化时间也可稍短，至少3分钟；因乙醇可溶于水，自来水或PBS润洗石蜡切片无时间要求，我们一般润洗，就是换水5-10次）；

（4）抗原修复：在高压锅（可用带气孔的蒸饭锅）中加入适量枸橼酸钠抗原修复液，将润洗好的石蜡切片没入枸橼酸钠抗原修复液中（液面没过组织），将高压锅放入微波炉中加热10 分钟至抗原修复液煮沸，打开锅盖检查有无气泡（有气泡表示枸橼酸钠抗原修复液已沸腾），盖好锅盖后继续加热5 分钟后打开锅盖在室温下自然冷却，正常约30分钟；

Tips：a、常用的修复方法有热修复、微波修复及高压修复，其抗原修复效果依次增强；b、常用的抗原修复液有枸橼酸钠抗原修复液、EDTA修复液，这两种抗原修复液对绝大多数抗原的修复均有相当良好的修复效果；c、对于相对较难检测的蛋白比如核蛋白优先选择高压修复，修复液最好参考抗体说明书；d、抗原修复时尤其是高压修复，需注意把握抗原修复时间（一般根据预实验决定修复时间），时间过长，容易导致组织脱片；

（5）PBS漂洗修复好的石蜡切片3次，每次5分钟；

（6）封闭内源性过氧化氢酶：采用3%的双氧水完全浸没石蜡切片，室温下避光封闭30分钟后，PBS漂洗石蜡切片3次，每次5 分钟；

tips：a、如不进行过氧化氢酶的封闭，容易引起非特异性染色，即背景；b、也有研究者采用3%的双氧水以滴加的方式封闭内源性过氧化氢酶；c、封闭时间至少15分钟；d、笔者习惯采用浸没的方式封闭内源性过氧化氢酶，并回收、重复使用，最长曾使用2月；e、3% 双氧水可用试剂公司的10%或30%的双氧水配制，亦可用医用双氧水配制；f、有的研究者会在抗原修复以前进行过氧化氢的封闭，笔者采用抗原修复以后进行过氧化氢封闭，两者简可，个人认为过氧化氢酶的活性在抗原修复以后能达到最佳状态，因此个人认为在抗原修复以后进行过氧化氢封闭，效果更佳。

（7）封闭内源性抗原：采用0.1% PBST配制的5% BSA抗原封闭液，室温封闭60 分钟（封闭原则同Western-blotting，常用的时5-10% BSA）；

（8）一抗孵育：滴加0.1% PBS稀释好的一抗工作液，4 ℃过夜（抗体孵育结束后可回收抗体，用于Western-Blotting，最好不要重复用于免疫组化），PBS漂洗3次，每次5 分钟；

（9）二抗孵育：滴加适量HRP标记过的对应种属的二抗工作液，室温孵育60 分钟；

（10）信号放大：滴加适量生物素底物，室温反应30 分钟后PBS漂洗3次，每次5 分钟；

（11）DAB显色：按照厂家的试剂使用说明配制1×DAB显色液，滴加至甩干的石蜡组织上，反应一段时间，显微镜下观察显色情况，及时用自来水终止染色，并用自来水润洗石蜡切片数次；

（12）苏木精复染：将润洗过的石蜡切片没入苏木精染液中10-20s，随后用自来水清洗苏木精染液，（大部分研究者也采用氨水返蓝：在氨水中浸润与提出组织3-4次，和盐水酒精分化：在盐酸酒精中浸润与提出石蜡切片3-4次，需注意氨水及盐水酒精和时间，否则容易导致脱色，脱色后亦可DAB再次显色，上述步骤根据苏木精的类型决定），后采用pH为7.2-7.4的PBS浸泡石蜡切片10分钟（PBS浸润时间可使得细胞核的蓝色和目的蛋白的棕色颜色更加鲜艳和靓丽，PBS浸泡时间越长，效果越好）；

（13）组织脱水：按下列步骤进行组织脱水， 70% 乙醇5分钟，85%乙醇5分钟，90% 乙醇5分钟，95% 乙醇5分钟，100% 乙醇10分钟，100% 乙醇10分钟（原理与水化类似）；

（14）石蜡透明：按以下步骤进行组织透明，二甲苯20 分钟，二甲苯20分钟；

（15）封片：滴加适量树脂封片，注意不要有气泡（待树脂干燥以后，可用二甲苯及无水乙醇擦洗拨片，去除多余树脂，保持拨片干净）；

（16）扫描石蜡组织切片并进行数据分析。